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幾種布魯氏菌病檢測方法比對結果分析

摘要：為比較幾種常用布魯氏菌?。ê喎Q布?。z測方法特性，在某疫苗免疫的奶牛場隨機選取40頭奶牛，采集血清和奶樣各40份，然后對采集的血清進行虎紅平板凝集、試管凝集、膠體金、酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA和cELISA）和瓊脂擴散方法檢測，對采集的奶樣進行病原學檢測（qPCR）和抗體檢測（膠體金）。結果顯示：4種國標方法（虎紅平板凝集、試管凝集、iELISA和cELISA）檢出的陽性樣品數(shù)量有較大差距，分別為16、6、23和33份，其中經(jīng)試管凝集試驗檢出的陽性血清，經(jīng)其他3種國標方法也檢測為陽性；通過膠體金法檢出陽性血清數(shù)（9份）略高于試管凝集試驗，且血清及牛奶樣品經(jīng)膠體金檢測結果基本一致；瓊擴法檢出12份陽性血清，且顯示抽檢奶牛中存在野毒感染；qPCR和膠體金試紙條對采集奶樣的檢測結果有較大差距，經(jīng)qPCR檢測僅1份樣品呈陽性。結果表明：國標方法中，試管凝集試驗特異性最高，iELISA和cELISA敏感性較高；病原學檢測臨床樣品檢出率較低，瓊脂擴散試驗敏感性有限，膠體金法敏感性適中，操作簡便，適合布病免疫奶牛場自檢。本研究為牛場布病不同檢測目的方法選擇提供了參考。

布魯氏菌病（brucellosis，簡稱布病）是一種流行范圍廣、危害嚴重的人獸共患病。目前有60多種動物可以作為布病儲存宿主。該病一年四季均可發(fā)生，流產(chǎn)為其典型發(fā)病癥狀。該病曾在20世紀50至70年代在國內(nèi)大范圍流行，此后經(jīng)過嚴格控制，在80年代保持了較低流行率。然而，從90年代開始該病發(fā)病率又明顯上升，現(xiàn)在已成為影響畜牧業(yè)和公共健康的重要危害之一。目前我國大陸地區(qū)的所有省級地區(qū)都有布病病例報道。

在布病流行嚴重的地區(qū)，往往采用疫苗免疫進行防控。目前主要使用A19、S2和M5等弱毒株活疫苗。其中A19弱毒株疫苗被廣泛采用，其有效期長，使用6×10⁹ CFU活菌的標準計量或稀釋10倍劑量的疫苗預防牛布病，均可以達到較好的免疫效果，免疫有效期可達72個月。A19疫苗株與國際上普遍使用的S19疫苗株同源性非常高，而后者是目前世界公認的防控奶牛布病最有效的疫苗株。

病原分離是診斷布病的金標準，但病原分離率低，分離條件嚴格，不便于普遍應用。血清學診斷是布病篩檢和確診的主要臨床診斷方法。國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB 18646—2018）中的免疫學檢測方法包括虎紅平板凝集、試管凝集、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（cELISA）和補體結合試驗等。其他免疫學檢測方法包括膠體金和熒光偏振。病原學檢測方法包括PCR和qPCR。

疫苗在提供保護的同時，也為布病的確診增加了困難。由于缺乏便捷有效的區(qū)別診斷方法，免疫牛群中自然感染牛和免疫陽性牛很難區(qū)分。本研究針對某免疫過A19株疫苗的奶牛場，采用多種檢測方式開展平行檢測。通過比較多種方法的檢測結果，分析該場是否存在野毒感染，同時比較不同方法的檢測特性。

材料與方法

奶樣、血清樣品

40份血清樣品和40份牛奶樣品，于2020年5月收集自某奶牛場4頭未免疫奶牛和36頭免疫A19株疫苗的奶牛。奶牛年齡、胎次以及距離最后一次免疫時間詳見表1。

國家標準方法

虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、cELISA、iELISA，均按照國標（GB 18646—2018）操作。

瓊脂擴散試驗

抗體瓊脂擴散（瓊擴）試驗基于布魯氏菌野毒株和疫苗株的表面抗原差異，可區(qū)分被檢動物是否存在野毒感染。血清中抗體與相應抗原在瓊脂膠中擴散，相遇后會結合形成沉淀線。試劑中的抗原包含一種布魯氏菌中普遍存在的脂多糖（LPS）和一種野毒株表面的多糖類半抗原（NH）。檢測時，在瓊脂膠中央孔里加入抗原，在周邊孔中加入陰陽性對照和血清樣品，室溫靜置24~48 h。若無沉淀線且對照成立，則認為動物無感染或免疫；若只出現(xiàn)LPS的沉淀線，則被檢動物很可能僅免疫未感染；若出現(xiàn)兩條沉淀線，則認為被檢動物存在野毒感染。

膠體金試紙條檢測法

吸取5 μL血清樣品滴入間接法膠體金試紙條加樣孔中，10~20 min觀察結果。當對照線和檢測線同時出現(xiàn)，則認為樣品為陽性。另用相同試紙條檢測牛奶樣品，方法同上。

病原學檢測

引物　采用熒光定量PCR（qPCR，探針法）對牛奶中布魯氏菌進行檢測。首先建立布魯氏菌屬（BSSP）和牛種布魯氏菌（BA）的標準曲線。BSSP作為通用引物，可檢測所有種的布魯氏菌，起到雙重檢測目的，從而保證陽性結果的準確性。引物信息詳見表2。

奶樣處理　吸取10 mL采集的奶液加入3%檸檬酸鈉-磷酸緩沖液，振蕩混勻，3 000 r/min離心30 min；用移液器將表層脂類及上清棄去，留下沉淀；加入PBS緩沖液（pH7.6），振蕩混勻，轉移至1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀保留下來；按照試劑盒說明書操作提取核酸，反應條件為95 ℃變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。

結果與分析

多份樣品在不同檢測方法中顯示出不同的陽性判定，結果見表3。

國標方法對血清樣品檢測

4種國標方法檢測出的陽性樣品數(shù)量有較大差距。虎紅平板凝集試驗檢出陽性樣品16份，陽性率為40.0%；試管凝集試驗檢出陽性樣品6份，陽性率為15.0%；cELISA和iELISA方法分別檢出陽性樣品33和23份，陽性率分別為82.5%和57.5%。其中，試管凝集試驗檢測的陽性血清（樣品1~6號），經(jīng)其他3種國標方法檢測也為陽性。

膠體金試紙條檢測

膠體金試紙條共檢出9份陽性血清（樣品1~9號），陽性率略高于試管凝集試驗。其中，樣品1~4號被所有血清學檢測方法判定為陽性，樣品5~7號被膠體金試紙條以外的4種血清學方法判定為陽性，樣品8、9號被虎紅平板凝集試驗、iELISA和cELISA 3種血清學方法判定為陽性。在牛奶樣品檢測中，膠體金試紙條檢測出10份陽性樣品，與同方法的血清學結果基本一致。對于所有經(jīng)虎紅平板凝集、試管凝集試驗檢測為強陽性的樣品以及經(jīng)瓊擴法判定為野毒感染的試驗牛，其奶樣經(jīng)膠體金試紙條檢測也均呈陽性。

瓊擴法檢測

瓊擴法檢測結果顯示，有12份陽性血清，其中7份是免疫陽性，5份為野毒感染。沒有出現(xiàn)瓊擴法單一檢測為陽性的血清樣品。瓊擴法檢測為野毒陽性的樣品中，除1份樣品為iELISA陰性外，其他均被所有血清學方法證實。當瓊擴法檢測出現(xiàn)野毒抗體沉淀線時，可認為該樣品存在野毒感染。但瓊擴法在具有高度特異性的同時，也損失了一定的敏感性，尤其是在讀取結果時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)沉淀線不夠清晰或者培養(yǎng)48 h后才能夠勉強觀察到沉淀現(xiàn)象。在本次檢測中，有3份瓊擴法檢測為陰性的樣品（樣品6、8、9號）被其他多種方法卻認定為陽性。

病原學檢測

BSSP qPCR標準曲線建立　目標基因插入pUC57質(zhì)粒。以3.47×10⁸ 拷貝/μL進行10倍梯度稀釋，獲得標準曲線方程Y = -3.12X+45.5，R2 = 0.991 2（圖1），具有良好的線性關系。

BA qPCR標準曲線建立　目標基因插入pUC57質(zhì)粒。以6.34×10⁸拷貝/μL進行10倍梯度稀釋，獲得標準曲線方程Y = -3.43X+32.4，R2 = 0.997 3（圖2），具有良好的線性關系。

qPCR檢測　對采集奶樣進行qPCR檢測，結果只有1份呈現(xiàn)BSSP和BA陽性。

未免疫牛血清檢測

未免疫牛共采集血清4份（樣品15、21、35、36號），在瓊擴法、iELISA和cELISA檢測中，有2份樣品（樣品15、21號）分別被2種方法檢測為陽性。

討論

在本研究中，不同方法表現(xiàn)出了不同特點。試管凝集試驗比虎紅平板凝集試驗顯示出更高的特異性，這也正是虎紅平板凝集試驗作為初篩，試管凝集試驗用以確診的原因。本研究中，試管凝集和虎紅平板凝集試驗均顯示為強陽性的樣品（樣品1~4號），其他血清學方法也顯示為陽性，且瓊擴法顯示存在野毒感染。但是試管凝集試驗操作繁瑣，等待時間長，而且需要符合要求的實驗室環(huán)境。虎紅平板凝集試驗雖然操作簡便，但是對檢測人員的經(jīng)驗有一定要求，實際檢測工作中，對同樣的結果經(jīng)常出現(xiàn)不同的判讀標準。雖然沒有采用細菌分離鑒定的金標準，但是根據(jù)多種方法的檢測結果，可以確定本牛場存在野毒感染。通常情況下，奶牛的免疫抗體在6個月后就無法檢出。然而，本場奶牛免疫時間均超過一年，很多血清樣品仍可以檢出抗體陽性。這可能是由于本場存在野毒感染且排菌的動物，持續(xù)刺激其他免疫奶牛保持抗體存在。為了最大程度且成本可控的降低風險，一種簡便可信的鑒別野毒感染方法就顯得尤為重要。

瓊擴法雖然能夠直接指明免疫動物中是否存在野毒感染，但是其檢測成本較高，敏感性有限，對檢測人員的操作經(jīng)驗也有一定要求，難以在牛場普及。iELISA和cELISA的敏感性過高，疫苗免疫抗體會嚴重影響檢測結果。本研究中，有7份血清樣品僅在兩種ELISA方法中顯示為陽性（樣品21~27號），另有6份（樣品28~33號）僅在cELISA中顯示為陽性。ELISA方法可以敏感地發(fā)現(xiàn)疫苗抗體，但在免疫場判斷是否存在野毒感染時，幾乎不具有參考性。qPCR有很好的特異性，但是對實驗環(huán)境、操作、設備都有較高要求，而且樣品中的病原含量可能很低，在不分菌培養(yǎng)的情況下，往往很難直接捕捉到病原核酸。在本研究中，僅有1份奶樣在qPCR方法檢測中顯示為陽性。

間接法膠體金試紙條在本次試驗中展示出了較好的參考價值，其所有血清檢測陽性的樣品被至少3種其他方法所支持，而且對奶樣檢測時，也表現(xiàn)出了與血清學方法良好的符合度，在生產(chǎn)現(xiàn)場具有很好的應用價值。這是因為對于產(chǎn)奶期的奶牛無需采血，減少了對動物的刺激，擠奶時可以當場檢測，操作簡單、結果清晰。

針對免疫過的奶牛，目前沒有一種簡便有效鑒別野毒感染的方法。但是通過對幾種檢測方法的比較分析，間接法膠體金試紙條顯示出了較好的參考意義和方便的操作性。對于布病免疫奶牛場，可以在不采血的情況下，通過奶樣快速篩查出存在布魯氏菌感染風險的牛，然后及時對其隔離觀察，送樣品到當?shù)貏游镆呖夭块T檢測，做好人員防護和無害化處理工作。

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